Физиология кетоза

Для раскрытия физиологии кетогенной диеты необходимо разобрать ряд тем. Глава 3 рассматривает использование различных видов топлива (глюкоза, белок, жир, кетоны) — это база, не специфичная именно для кетогенной диеты, но необходимая для понимания дальнейших глав.

Главы 4 и 5 посвящены кетоновым телам, кетогенезу и адаптациям, возникающим на кетогенной диете. Автор отмечает, что это самые технически сложные главы книги, но критически важные для понимания основ метода. Часть описанных адаптаций хорошо установлена, часть — менее. Чтобы не превращать изложение в университетский курс биохимии, многие мелкие детали опущены — заинтересованным читателям рекомендуется обращаться к цитируемым источникам, особенно к недавним обзорным статьям.

Глава 6 рассматривает вопрос, вызывает ли кетогенная диета большую потерю веса, воды, жира и белка по сравнению с более традиционной диетой для снижения жира. Глава 7 рассматривает прочие метаболические эффекты кетоза.

Часть II включает главы 3-7: основы топливного метаболизма (гл. 3), основы физиологии кетоновых тел (гл. 4), адаптации к кетозу (гл. 5), изменения состава тела (гл. 6), прочие эффекты кетогенной диеты (гл. 7).

Глава 3
Основы топливного метаболизма

Главная идея главы

1. Запасы топлива в организме

Ключевая мысль

Организм располагает тремя основными депо топлива (белок, углеводы, жир) плюс потенциальное четвёртое топливо — кетоны; при этом запасы углеводов крайне малы по сравнению с белком и жиром.

Подробное объяснение

Автор выделяет три депо, которые организм использует при дефиците калорий:

• Белок — может конвертироваться в глюкозу в печени и использоваться для энергии;
• Углеводы — хранятся преимущественно как гликоген в мышцах и печени;
• Жир — хранится преимущественно как жировая ткань тела.

Четвёртое потенциальное топливо — кетоны. При обычном питании их роль в энергопродукции практически отсутствует; при голодании или на кетогенной диете кетоны начинают играть значительно большую роль, особенно для мозга.

Клинические данные (таблица автора)

Автор приводит сравнение запасов топлива для условного мужчины весом 150 фунтов (~68 кг) с 22% жировой массы (источник: Devlin, «Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations», 4-е изд., 1997):

*Вес переведён из исходных фунтов автора в килограммы для удобства восприятия; энергетическая ценность приведена как в оригинале.

Клиническое значение

Главный вывод из таблицы: запасы углеводов минимальны по сравнению с белком и жиром — их достаточно примерно на одни сутки энергообеспечения. Хотя теоретически запасённый белок мог бы обеспечивать организм энергией значительно дольше, чем углеводы, чрезмерные потери белка в конце концов приводят к смерти. Таким образом, жировая ткань остаётся главным депо для долгосрочного энергетического запаса. У среднего человека запасов жира достаточно, чтобы существовать без приёма пищи в течение недель или месяцев; описаны случаи голодания у людей с выраженным ожирением продолжительностью до года.

2. Взаимосвязи между видами топлива

Ключевая мысль

Хотя формально в организме четыре вида топлива, для практических целей достаточно рассматривать только глюкозу и СЖК — белок и кетоны тесно связаны с ними и могут быть «встроены» в эту модель.

Глюкоза и белок

Глюкоза — предпочтительное топливо для большинства тканей при достаточном её количестве (главное исключение — сердце, использующее смесь глюкозы, СЖК и кетонов). Основной источник глюкозы — углеводы пищи, но другие вещества также могут превращаться в глюкозу в печени и почках через глюконеогенез («глюко» = глюкоза, «нео» = новый, «генезис» = образование), включая некоторые аминокислоты (в первую очередь аланин и глутамин).

При нормальной доступности глюкозы глюконеогенез из белковых запасов организма минимален. Отсюда распространённое утверждение, что углеводы дают «белоксберегающий» эффект (предотвращают расщепление белка для производства глюкозы). Автор уточняет: это верно, но часто упускается, что то же высокое потребление углеводов одновременно снижает использование жира как топлива — то есть углеводы являются не только «белоксберегающими», но и «жиросберегающими».

Если потребность в глюкозе высока, а её доступность низка (как в первые дни голодания), организм начинает расщеплять собственные белковые запасы для производства глюкозы — именно это, по мнению автора, вероятно, и стало источником представления о том, что низкоуглеводные диеты «съедают» мышцы. Однако (как обсуждается в следующей главе) адекватное потребление белка в первые недели кетогенной диеты предотвращает потерю мышц, обеспечивая аминокислоты для глюконеогенеза, которые иначе были бы взяты из белков тела.

По мере того как доступность альтернативных видов топлива (СЖК и кетонов) увеличивается, а потребность в глюкозе снижается, потребность в глюконеогенезе из белка также снижается. Поскольку расщепление белка тесно связано с потребностью и доступностью глюкозы, эти два топлива можно рассматривать совместно. Автор подчёркивает: основная адаптация к кетогенной диете — снижение использования глюкозы организмом, что и обеспечивает белоксберегающий эффект (подробнее — в главе 5).

Свободные жирные кислоты (СЖК) и кетоны

Большинство тканей организма (скелетные мышцы, сердце, большинство органов) способны использовать СЖК как топливо. Однако есть ткани, которые СЖК использовать не могут и требуют глюкозу: мозг, эритроциты, мозговое вещество почек, костный мозг и волокна мышц II типа.

Факт, что мозг не может использовать СЖК напрямую, привёл к одному из крупнейших заблуждений о физиологии человека — представлению, что мозг может использовать только глюкозу. Это неверно: хотя в норме мозг работает на глюкозе, при наличии кетонов он охотно использует их как топливо. Автор отмечает, что мозг — едва ли не самая важная ткань с точки зрения утилизации кетонов: после адаптации он может получать до 75% от общих энергозатрат именно из кетонов. Скорее всего, кетоны существуют главным образом именно для обеспечения мозга жиро-производным топливом в периоды недоступности углеводов.

Использование кетонов, как и глюкозы/СЖК, зависит от их концентрации. При обычном питании концентрация кетонов настолько низка, что их вклад в энергообеспечение тканей незначителен. При повышении их концентрации большинство тканей начинают получать часть энергии из кетонов; некоторые исследования даже указывают, что кетоны являются предпочтительным топливом для многих тканей. Исключение — печень, которая не использует кетоны как топливо, полагаясь вместо этого на СЖК.

К третьему дню кетоза всё небелковое топливо организм получает за счёт окисления СЖК и кетонов. По мере развития кетоза большинство тканей, способных использовать кетоны, к третьей неделе значительно снижают их использование — за счёт снижения активности (down-regulation) ферментов, отвечающих за утилизацию кетонов, во всех тканях, кроме мозга. После трёх недель большинство тканей почти полностью обеспечивают свои энергетические потребности за счёт расщепления СЖК. Автор предполагает, что это — адаптация, обеспечивающая достаточный уровень кетонов именно для мозга.

За исключением сахарного диабета 1 типа, кетоны появляются в кровотоке только при условии повышенного использования СЖК организмом. Для практических целей можно считать, что значительное увеличение использования СЖК сопровождается увеличением утилизации кетонов, и эти два топлива можно рассматривать совместно.

Взаимосвязь углеводов и жира

Избыток углеводов пищи теоретически может превращаться в жир в печени через процесс de novo липогенеза (DNL). Однако кратковременные исследования показывают, что DNL не вносит значимого вклада в набор жировой массы у людей. До тех пор, пока запасы гликогена мышц и печени не полностью заполнены, организм способен запасать или сжигать избыточные углеводы пищи — но этот процесс происходит за счёт ограничения сжигания жира, то есть любой жир пищи, потребляемый вместе с высоким количеством углеводов, будет запасён как жир тела.

При определённых условиях избыточные углеводы пищи действительно могут проходить через DNL и запасаться в жировых клетках, хотя вклад этого процесса в набор жира считается минимальным. Эти условия возникают, когда гликоген мышц и печени уже заполнен, а потребление углеводов избыточно. Наиболее вероятный сценарий — малоподвижный образ жизни в сочетании с избыточным потреблением углеводов/калорий. Сочетание неактивности с одновременно очень высоким потреблением и углеводов, И жира значительно хуже в отношении набора жировой массы: при хронически переполненных запасах гликогена и высоком потреблении углеводов использование жира почти полностью блокируется, и весь потребляемый жир пищи запасается.

Это привело некоторых авторов к рекомендации абсолютно минимизировать жир в рационе для снижения веса — логика в том, что поступающие углеводы блокируют сжигание жира организмом, поэтому нужно есть меньше жира, чтобы избежать его запасания. Кетогенная диета подходит к этой же проблеме с противоположной стороны: за счёт снижения потребления углеводов до минимума использование жира организмом максимизируется.

Итоговая формула главы

3. Факторы, влияющие на использование топлива

Ключевая мысль

На выбор топлива организмом влияют четыре основных фактора: количество потребляемых нутриентов, уровни гормонов, запасы нутриентов в организме и активность регуляторных ферментов.

3.1 Количество потребляемых нутриентов

Калории человек может получать из четырёх источников: углеводов, белка, жира и алкоголя. Организм, как правило, использует данное топливо в энергетических целях пропорционально его доступности и концентрации в крови.

• Углеводы: использование глюкозы организмом увеличивается или уменьшается прямо пропорционально количеству потребляемых углеводов — это попытка поддерживать запасы гликогена на определённом уровне.
• Белок: регулируется слабее. При увеличении потребления белка несколько повышается и его окисление; при снижении потребления — организм использует для энергии меньше белка. Это попытка поддерживать постоянный уровень белковых запасов организма.
• Жир: в противоположность углеводам и белку, количество потребляемого жира пищи не существенно увеличивает использование жира организмом как топлива. Окисление жира определяется не напрямую количеством съеденного жира, а опосредованно — потреблением алкоголя и углеводов.

Потребление алкоголя почти полностью подавляет использование жира организмом как топлива. Аналогично, потребление углеводов влияет на количество используемого жира: высокоуглеводная диета снижает использование жира как топлива, и наоборот. Таким образом, наибольшая скорость окисления жира достигается именно при ограничении углеводов. Также уровень гликогена мышц регулирует, сколько жира использует мышца (подробнее — в главе 18); использование физической нагрузки и/или ограничения углеводов для снижения уровня гликогена мышц и печени увеличивает утилизацию жира.

3.2 Уровни гормонов

Главный регуляторный гормон — инсулин; его уровень в значительной степени определяет уровни других гормонов и общий метаболизм организма.

Инсулин — детали механизма

Инсулин высвобождается поджелудочной железой преимущественно в ответ на повышение глюкозы крови. При росте глюкозы крови растёт и инсулин, что приводит к запасанию глюкозы как гликогена в мышцах/печени; избыток глюкозы может направляться в жировые клетки (в виде альфа-глицерофосфата). Стимулируется синтез белка, свободные аминокислоты перемещаются в мышечные клетки и включаются в состав белков. Стимулируются синтез жира (липогенез) и его запасание. Даже небольшие количества инсулина подавляют высвобождение СЖК из жировых клеток.

Главная роль инсулина — удерживать глюкозу крови в относительно узком диапазоне ~80–120 мг/дл. Наибольший подъём глюкозы крови (и, соответственно, инсулина) вызывают углеводы пищи; белок вызывает менее выраженный подъём инсулина (так как некоторые аминокислоты могут конвертироваться в глюкозу); СЖК и высокие концентрации кетоновых тел также могут стимулировать высвобождение инсулина, но в значительно меньшей степени, чем углеводы или белок (подробнее — в главе 4).

При падении глюкозы крови (физическая нагрузка, ограничение углеводов) инсулин снижается, а такие гормоны, как глюкагон, повышаются — организм начинает расщеплять запасённое топливо: триглицериды жировых клеток расщепляются на СЖК и глицерол и высвобождаются в кровоток; белки могут расщепляться на аминокислоты для производства глюкозы; гликоген печени расщепляется до глюкозы и высвобождается в кровоток.

Невозможность вырабатывать инсулин — патологическое состояние, называемое сахарным диабетом 1 типа (инсулинозависимый сахарный диабет, ИЗСД). У больных ИЗСД дефект поджелудочной железы полностью лишает их способности производить или высвобождать инсулин; такие пациенты должны вводить инсулин извне для поддержания нормального уровня глюкозы крови. Автор отмечает, что это будет важно при разборе различия между диабетическим кетоацидозом и диетически индуцированным кетозом в следующей главе.

Глюкагон — детали механизма

Глюкагон — по сути «зеркальный» гормон инсулина с противоположными эффектами; также является пептидным гормоном поджелудочной железы, и его основная роль — также поддержание уровня глюкозы крови, но за счёт повышения её уровня, когда он падает ниже нормы.

Главное действие глюкагона реализуется в печени — он стимулирует расщепление гликогена печени с высвобождением глюкозы в кровоток. Высвобождение глюкагона стимулируется падением глюкозы/инсулина крови, физической нагрузкой и приёмом белковой пищи. Высокий уровень инсулина подавляет высвобождение глюкагона поджелудочной железой.

В норме глюкагон оказывает незначительное влияние на ткани помимо печени (жир, мышцы). Однако при очень низком инсулине (как при ограничении углеводов и физической нагрузке) глюкагон начинает играть небольшую роль также в расщеплении гликогена мышц и мобилизации жира. Помимо основной роли в поддержании глюкозы крови при гипогликемии, глюкагон играет ключевую роль в образовании кетоновых тел в печени (детально — в следующей главе).

Инсулин и глюкагон антагонистичны друг другу: инсулин — преимущественно гормон запасания (увеличивает запасание глюкозы, белка и жира), глюкагон — мобилизует эти же запасы топлива для использования организмом. Как правило, при высоком инсулине уровень глюкагона низкий, и наоборот. Большая часть литературы (особенно в отношении образования кетоновых тел) делает акцент именно на соотношении инсулина к глюкагону — инсулин/глюкагоновое соотношение (I/G ratio), а не на абсолютных уровнях каждого гормона по отдельности. Это соотношение — важный фактор в обсуждении кетогенеза в следующей главе.

Прочие гормоны — детали

Соматотропин (GH) высвобождается в ответ на различные стрессоры, важнейшие из которых для целей книги — физическая нагрузка, снижение глюкозы крови и ограничение углеводов/голодание. Большинство анаболических эффектов GH, по всей видимости, реализуется через класс гормонов — соматомедины, также называемые инсулиноподобными факторами роста (IGF). Главный IGF в организме человека — IGF-1, обладающий анаболическими эффектами на большинство тканей. GH стимулирует выработку IGF-1 печенью, но только в присутствии инсулина.

Высокий GH в сочетании с высоким инсулином (как при приёме пищи, содержащей белок и углеводы) повышает уровень IGF-1 и усиливает анаболические реакции в организме. Напротив, высокий GH при низком инсулине (как при голодании или ограничении углеводов) не приводит к повышению IGF-1. Это одна из причин, почему кетогенные диеты не идеальны для ситуаций, требующих синтеза тканей (например, рост мышц или восстановление после некоторых травм): недостаток инсулина может снижать уровень IGF-1 и влиять на синтез белка.

Тиреоидные гормоны — тироксин (Т4) и трийодтиронин (Т3), выделяются щитовидной железой в соотношении примерно 80% Т4 к 20% Т3. Т4 в основном является депо-формой Т3 и сам по себе играет немного физиологических ролей; большая часть Т3 не выделяется напрямую щитовидной железой, а образуется из Т4 в других тканях, преимущественно в печени. Хотя тиреоидные гормоны влияют на все ткани организма, автора в первую очередь интересуют их эффекты на метаболическую скорость и синтез белка (влияние низкоуглеводных диет на тиреоидные гормоны рассматривается в главе 5).

Кортизол — катаболический гормон коры надпочечников, участвующий в реакциях, связанных с использованием топлива, включая расщепление белка до глюкозы и расщепление жира. Хотя кортизол абсолютно необходим для жизни, его избыток (вызванный стрессом и другими факторами) вреден в долгосрочной перспективе — вызывает постоянное истощение белков организма, включая мышцы, кости, соединительную ткань и кожу. Кортизол, как правило, играет «разрешающую» (пермиссивную) роль, позволяя другим гормонам работать эффективнее.

Адреналин и норадреналин (эпинефрин и норэпинефрин) часто называют гормонами «бей или беги». Они высвобождаются в ответ на стресс — физическую нагрузку, холод, голодание. Эпинефрин выделяется преимущественно из мозгового вещества надпочечников и действует через кровоток на большинство тканей; норэпинефрин выделяется преимущественно из нервных окончаний и действует только на определённые ткани. Автор отмечает, что взаимодействия катехоламинов с разными тканями весьма сложны и выходят за рамки книги; главная их роль в контексте кетогенной диеты — стимуляция высвобождения СЖК из жировых клеток. При низком инсулине именно эпинефрин и норэпинефрин участвуют в мобилизации жира; у человека только инсулин и катехоламины оказывают реальное влияние на мобилизацию жира, при этом инсулин подавляет расщепление жира, а катехоламины — стимулируют его.

3.3 Гликоген печени

Печень — один из метаболически наиболее активных органов в организме; вся пища, проходящая через пищеварительный тракт, первично обрабатывается именно в печени. Уровень гликогена печени в значительной степени определяет общую тенденцию организма к запасанию либо расщеплению нутриентов; кроме того, высокий уровень гликогена печени ассоциирован с более высоким уровнем жировой массы тела.

Печень, по сути, краткосрочное депо гликогена, используемое для поддержания глюкозы крови. Расщепление гликогена печени до глюкозы стимулируется повышением глюкагона.

Когда гликоген печени заполнен, глюкоза крови поддерживается, и организм в целом находится в анаболическом состоянии: поступающая глюкоза, аминокислоты и СЖК запасаются соответственно как гликоген, белки и триглицериды — это иногда называют «состоянием сытости» (fed state).

Когда гликоген печени истощается (за счёт интенсивной физической нагрузки или отсутствия углеводов пищи), печень меняет роль и переходит в катаболическое состояние: гликоген расщепляется до глюкозы, белки — до аминокислот, триглицериды — до СЖК. Это иногда называют «состоянием голода» (fasted state).

При достаточном истощении гликогена печени глюкоза крови падает, происходит соответствующий сдвиг соотношения инсулина и глюкагона — это запускает образование кетоновых тел (кетогенез), что подробно рассматривается в следующей главе.

3.4 Активность ферментов

Последний регулятор использования топлива в организме — активность ферментов. В конечном счёте уровни ферментов определяются потребляемыми нутриентами и гормональными уровнями, которые из этого следуют.

Например, когда потребляются углеводы и инсулин высок, стимулируются ферменты, отвечающие за использование глюкозы и запасание гликогена, а ферменты, отвечающие за расщепление жира, подавляются. Аналогично, при снижении инсулина ферменты использования глюкозы подавляются, а ферменты расщепления жира — активируются.

Долгосрочная адаптация к высокоуглеводной или низкоуглеводной диете может вызывать более долгосрочные изменения в активности ферментов, отвечающих за использование жира и углеводов. Если человек не потребляет углеводы в течение нескольких недель, происходит снижение активности (down-regulation) ферментов печени и мышц, отвечающих за запасание и сжигание углеводов. Итоговый эффект этого — временная сниженная способность использовать углеводы как топливо в первое время после их повторного введения в рацион.

Медицинские термины

Биохимические и физиологические механизмы (сводно)

1. Доступность углеводов пищи определяет уровень глюкозы крови → уровень глюкозы крови определяет уровень инсулина → инсулин определяет соотношение запасания/мобилизации топлива в организме.
2. Высокий инсулин подавляет высвобождение СЖК из жировых клеток даже в небольших количествах — ключевой механизм, объясняющий, почему углеводы блокируют использование жира как топлива.
3. Истощение гликогена печени → снижение глюкозы крови → снижение инсулина и рост глюкагона → переход печени из «состояния сытости» в «состояние голода» → запуск кетогенеза.
4. Мозг в норме использует глюкозу, но способен покрывать до 75% энергозатрат кетонами после адаптации — поскольку не может напрямую утилизировать СЖК.
5. По мере развития кетоза (к 3-й неделе) большинство тканей, кроме мозга, снижают использование кетонов за счёт down-regulation соответствующих ферментов — предположительно, чтобы «оставить» достаточно кетонов именно для мозга.
6. Долгосрочное безуглеводное питание вызывает снижение активности ферментов запасания/сжигания углеводов в печени и мышцах — отсюда временное снижение толерантности к углеводам при их повторном введении.

Практические выводы автора

• Для практического анализа метаболизма достаточно рассматривать взаимосвязь глюкозы и СЖК — белок и кетоны можно «привязать» к этой базовой модели.
• Утверждение, что мозг может использовать «только глюкозу» — распространённое заблуждение: мозг охотно использует кетоны при их доступности и может получать из них до 75% энергии.
• Представление о низкоуглеводных диетах как однозначно «съедающих мышцы», вероятно, происходит из наблюдений первых дней голодания/ограничения углеводов, когда глюконеогенез из белка повышен; адекватный белок в рационе предотвращает эту потерю.
• Углеводы пищи являются не только «белоксберегающими», но и «жиросберегающими» — это снижает эффективность простого повышения углеводов как способа защитить мышцы без учёта влияния на жировой обмен.
• Базовый принцип кетогенной диеты — заставить организм сжигать больше жира, снижая использование им глюкозы за счёт ограничения углеводов.
• Регуляция использования топлива определяется четырьмя факторами: количеством потребляемых нутриентов, уровнями гормонов, статусом депо гликогена печени/мышц и активностью регуляторных ферментов — все они, в конечном счёте, зависят от потребления углеводов.

Что обязательно запомнить врачу

Список источников, упомянутых в главе

1. "Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations" 4th ed. Ed. Thomas M. Devlin. Wiley-Liss, 1997.
2. Cahill G. Starvation in man. N Engl J Med (1970) 282: 668–675.
3. "Textbook of Medical Physiology" Arthur C. Guyton. W.B. Saunders Company, 1996.
4. Owen OE, et al. Brain metabolism during fasting. J Clin Invest (1967) 10: 1589–1595.
5. Sokoloff L. Metabolism of ketone bodies by the brain. Ann Rev Med (1973) 24: 271–280.
6. Cahill G. Ketosis. Kidney International (1981) 20: 416–425.
7. Mitchell GA, et al. Medical aspects of ketone body metabolism. Clinical & Investigative Medicine (1995) 18: 193–216.
8. Swink TD, et al. The ketogenic diet: 1997. Adv Pediatr (1997) 44: 297–329.
9. Robinson AM, Williamson DH. Physiological roles of ketone bodies as substrates and signals in mammalian tissues. Physiol Rev (1980) 60: 143–187.
10. Nosadini R, et al. Ketone body metabolism: A physiological and clinical overview. Diabet/Metab Rev (1989) 5: 299–319.
11. Krebs HA, et al. The role of ketone bodies in caloric homeostasis. Adv Enzym Regul (1971) 9: 387–409.
12. Elia M, et al. Ketone body metabolism in lean male adults during short-term starvation. Clinical Science (1990) 78: 579–584.
13. Owen OE, et al. Protein, fat and carbohydrate requirements during starvation: anaplerosis and cataplerosis. Am J Clin Nutr (1998) 68: 12–34.
14. Hellerstein M. Synthesis of fat in response to alterations in diet. Lipids (1996) 31(suppl): S117–S125.
15. Flatt JP. Use and storage of carbohydrate and fat. Am J Clin Nutr (1995) 61(suppl): 952S–959S.
16. Flatt JP. McCollum Award Lecture, 1995: Diet, lifestyle, and weight maintenance. Am J Clin Nutr (1995) 62: 820–836.
17. Randle PJ. Metabolic fuel selection: general integration at the whole-body level. Proc Nutr Soc (1995) 54: 317–327.
18. Randle PJ, et al. Glucose fatty acid interactions and the regulation of glucose disposal. J Cell Biochem (1994) 55(suppl): 1–11.
19. Flatt JP. Glycogen levels and obesity. Int J Obes (1996) 20(suppl): S1–S11.
20. Schrauwen P, et al. Role of glycogen-lowering exercise in the change of fat oxidation in response to a high-fat diet. Am J Physiol (1997) 273: E623–E629.
21. Schrauwen P, et al. Fat balance in obese subjects: role of glycogen stores. Am J Physiol (1998) 274: E1027–E1033.
22. Flatt JP. Integration of the overall response to exercise. Int J Obes (1995) 19(suppl): S31–S40.
23. Cahill GF Jr, et al. Hormone-fuel relationships during fasting. J Clin Invest (1966) 45: 1751–1769.
24. Cahill GF. Banting Memorial Lecture 1971: Physiology of insulin in man. Diabetes (1971) 20: 785.
25. Foster D. Banting Lecture 1984 — From Glycogen to Ketones — and Back. Diabetes (1984) 33: 1188–1199.